談補陽還五湯對腦缺血大鼠神經功能及細胞形態的影響論文
腦缺血屬中風范疇，是臨床常見病，具有高發病率、高死亡率及高致殘率的特點，嚴重危害著人類健康。迄今為止，國內外在治療腦缺血及其后遺癥方面還缺少有效的化學治療藥物。循證醫學表明，中醫藥對缺血性腦卒中的治療有一定優勢。當前大量研究集中在中藥對急性腦缺血損傷的保護作用。而腦缺血后的功能恢復是一個較長時間過程，目前對其進行較長時間觀察的研究較少。出自清代王清任《醫林改錯》的補陽還五湯，是治療缺血性中風及中風后遺癥的經典名方，該方在臨床上應用廣泛且療效確切，但其促神經功能恢復機制還需進一步闡明。本文采用大腦中動脈線栓法復制大鼠局灶性腦缺血模型，探討了補陽還五湯較長時間多時間點對其神經功能的保護作用，以期為治療缺血性腦中風臨床用藥提供實驗依據。
1 材料
1. 1 動物健康雄性SD 大鼠189 只，SPF 級，體重260 ～ 280 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，生產許可證號SCXK( 湘) 2009-0004，動物合格證號004535。
1. 2 藥物補陽還五湯處方來源于清·王清任《醫林改錯》，按原方組成: 黃芪120 g，赤芍4. 5 g，川芎3 g，歸尾6 g，干地龍3 g，紅花3 g，桃仁3 g，藥材經湖南中醫藥研究院鑒定均符合《中國藥典》2005 年版標準。補陽還五湯藥劑制備: 飲片先用清水浸泡30 min，第一煎加藥材及5 倍體積雙蒸水，煎煮60min，二煎5 倍體積雙蒸水，煎煮60 min，兩煎混勻，濃縮至含生藥2 g·mL - 1，冷藏待用。
1. 3 試劑10% 水合氯醛( 揚州市奧鑫助劑廠) ，多聚甲醛( 長沙市錦華化工有限公司) ，TTC( 紅四氮唑，Sigma 公司) 。
1. 4 儀器Bx51 光學顯微鏡及IPP5. 1 圖像分析系統( 日本Olympus) ，FA 型電子天平( 上海臺之衡電子衡器有限公司) ，自動雙重純水蒸餾器( 上海玻璃儀器一廠) ，Finesse 325 型石蠟切片機( 英國Shando) 。
2 方法
2. 1 分組與給藥將大鼠隨機分為假手術組、模型組和補陽還五湯組，每組63 只，每組動物又分3 個時間點，即分別于首次給藥后7， 14， 21 d 處死，每個時間點21 只動物。補陽還五湯組動物于術后2 h后開始給藥，給藥劑量為5 g·kg - 1·d - 1，每日ig 1次。模型組和假手術組動物均給予等體積蒸餾水。
2. 2 模型制備與評價參照文獻采用大腦中動脈線栓法復制大鼠局灶性腦缺血模型: 10% 水合氯醛( 3. 5 mL·kg - 1 ) ip 麻醉，取頸正中切口長約3cm，逐層分離，結扎頸外動脈，夾閉頸內動脈、再結扎頸總動脈，于頸總動脈充盈分叉部下方約4 mm處將一長為4 cm 直徑為0. 26 mm 的尼龍魚線插入頸內動脈，直到遇到輕微阻力為止，固定尼龍線，縫合切口。假手術組僅切開皮膚、分離左側頸總動脈后隨即縫合。術后將動物置于放有清潔墊料的飼養盒內，自由飲水、進食。動物清醒2 h 后參照Longa及Bederson的5 分制法進行神經功能評分，分值在1 ～ 3 分者入組。0 分: 無神經損傷癥狀; 1 分: 不能完全伸展對側前爪; 2 分: 向對側轉圈; 3 分: 向對側傾倒; 4 分: 不能自發行走，意識喪失。評分越高，神經功能缺損越嚴重，反之亦然。不納入標準: 評分低于1 分; 蛛網膜下腔出血; HE 染色無腦缺血病理改變; 未到時間點死亡。死亡等不足動物時隨機替補。
2. 3 指標檢測
2. 3. 1 TTC 染色測腦梗死面積比每組每個時間點5 只大鼠， 10% 水合氯醛麻醉后，斷頭取大腦，置于- 20 ℃ 冷凍20 min 后，自額極每隔2 mm 切1片。第1 刀在腦前極與視交叉連線中點處; 第2 刀在視交叉部位; 第3 刀在漏斗柄部位; 第4 刀在漏斗柄與后葉尾極之間，共A，B，C，D，E 5 片。用2%的紅四氮唑染色，37 ℃下避光30 min，正常組織呈深紅色，而梗死組織則為白色。拍照后選最大缺血斷面C 片梗死面積，運用Image-Pro Express 圖像分析系統掃描計算，取梗死面積占C 片大腦總面積的百分比表示。為消除梗死側大腦半球因腦水腫造成的誤差，按Swanson 方法進行校正后計算C 片梗死面積百分比( IS) 。IS = ( S1 - Sr) /2S1 × 100%S1: C 片健側總面積; Sr: C 片患側非梗死區面積。
2. 3. 2 神經功能評分每組每個時間點10 只大鼠，于術后2 h 及動物處死前1 h 進行神經功能評分。
2. 3. 3 HE 染色觀察海馬、皮質組織病理學變化每組每個時間點6 只。同2. 3. 1 取大腦后4% 多聚甲醛固定24 h，梯度乙醇脫水，常規石蠟包埋，腦冠狀連續切片( 片厚5 μm) ，取含海馬切片貼于載玻片上，隨后HE 染色，光鏡下觀察比較各組大鼠左側海馬、皮質組織細胞形態病理學改變。
2. 4 統計學分析
所有數據以珋x ± s 表示，應用SPSS 19. 0 統計軟件對數據進行統計分析，組間比較用單因素方差分析，P < 0. 05 被認為具有統計學意義。
3 結果
3. 1 各組腦梗死面積比較通過TTC 染色，假手術組著色比較均勻，為深紅色; 7， 14， 21 d 模型組與補陽還五湯組染色不均勻，局部梗死區為白色，梗死部位在缺血側頂葉大腦皮質、海馬周圍。梗死面積分析顯示，模型組和補陽還五湯組隨時間點后延腦梗死面積均逐漸縮小( P < 0. 05) ; 且7， 14， 21 d 補陽還五湯組梗死面積明顯小于同時相模型組，差異具有統計學意義( P < 0. 05) 。
3. 2 各組神經功能評分情況假手術組各時間點大鼠神經功能評分均為0 分; 補陽還五湯組各時間點神經功能評分均較同時相模型組低，差異具有統計學意義( P < 0. 05) 。
3. 3 各組海馬、皮質組織細胞形態學變化
3. 3. 1 海馬假手術組海馬細胞形態正常，細胞輪廓清晰可見，細胞核染色均勻，細胞排列整齊，間質著色均勻。7，14，21 d 模型組海馬神經細胞皺縮，出現細胞核固縮，核邊集嚴重，細胞內有空泡，細胞形態由橢圓形變成梭形、三角形，細胞間間距增大，間質染色稀疏，有空洞。7， 14， 21 d 補陽還五湯組海馬細胞空泡樣細胞較模型組明顯減少，細胞形態明顯改善，細胞排列較模型組整齊。7，14 d 補陽還五湯組仍存在少量核深染及空泡樣改變細胞，但21 d 補陽還五湯組海馬細胞形態接近假手術組。
3. 3. 2 皮質假手術組皮質細胞形態正常，邊緣清晰，排列整齊，形態完整，胞核著色均勻，細胞間質染色均勻。7，14，21 d 模型組缺血細胞呈空泡樣壞死，細胞形態喪失，細胞間間隙增大，染色變淺，呈網狀改變; 殘存細胞其體積縮小、細胞核固縮深染、細胞邊界不清。補陽還五湯組各時間點皮質細胞空泡樣細胞較同時間相模型組明顯減少，細胞形態明顯改善，細胞排列整齊，神經細胞核較清晰，細胞間隙染色較均勻。
4 討論
局灶性腦缺血又稱缺血性腦卒中，是由于腦的血液供應障礙，導致腦組織缺血、缺氧，所致相應區域腦梗死性壞死，大量神經元喪失，而產生相應的神經功能缺損癥狀與體征，是腦血管疾病中最為常見的臨床類型。目前西醫治療腦缺血的主要方法包括溶栓、抗凝、降纖、擴血管、高壓氧、介入治療等，還有尚處于動物實驗階段的基因治療、神經干細胞移植等。這些治療方法中除了超早期( 發病3 h 內)溶栓治療有效率高達21% ～ 93%，其他療法效果并不確定。而且溶栓治療因其嚴格的時間窗，意味著只有不到5% 的病人有機會進行這一治療。因此，缺血性腦中風的病人約80% 留下不同程度的后遺癥——神經功能缺損。
典型的缺血性腦卒中在臨床上可按照病程分為3 期。第1 期急性期，腦卒中后1 個月內; 第2 期恢復期，腦卒中后2 ～ 6 個月內; 第3 期后遺癥期，腦卒中6 個月后。補陽還五湯主要用于腦缺血恢復期及后遺癥期治療，是治療腦缺血后遺癥的首選方，臨床應用療效顯著。因此在動物實驗中我們觀察的時間點最長達到缺血后21 d，這相當于人腦缺血后遺癥期。本實驗研究中，神經功能評分結果表明補陽還五湯能促進腦缺血后大鼠神經功能恢復。其作用機制有學者認為與促血管生成、擴血管、抗凝、溶栓等改善腦缺血局部微循環，減輕腦水腫及氧自由基損傷，保護腦組織，從而促進神經功能恢復。本實驗室及國內其他實驗室研究表明補陽還五湯能促進缺血后腦內神經干細胞增殖、遷移、分化，可能也是其促進缺血后神經功能恢復機制之一。通過比較各組動物腦梗死面積比，結果顯示補陽還五湯各時間點分別較同時間相模型組腦梗死面積明顯縮小�？赡艿脑蛴�: 其一，補陽還五湯在腦缺血急性期起腦保護作用，抑制了大量神經元死亡與凋亡導致梗死面積變小; 其二，補陽還五湯促進缺血后腦組織再生、修復、代償，而導致梗死面積較相應的模型組縮小; 二者也可能兼而有之。另外，通過比較補陽還五湯組與模型組缺血后海馬、皮質組織學改變，結果表明補陽還五湯能明顯改善細胞形態與排列，促進腦缺血損傷后組織修復。
總之，本研究證實了補陽還五湯具有降低腦缺血神經功能評分、減小腦梗死面積、改善腦組織細胞形態與排列的腦保護作用，為該藥臨床治療缺血性腦卒中提供了有力的實驗依據。
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