微生物對正十六烷的運輸富集機理研究
1 引言
目前，生物修復被認為是最為經濟有效的處理石油污染土壤的技術，主要依靠環(huán)境中的微生物以有機污染物為碳源進行新城代謝，從而凈化土壤[1-2]。微生物細胞膜的功能之一是擴散屏障，即阻止碳氫化合物和親脂性化合物向細胞內擴散[3]，但大量研究表明吸附在微生物細胞表面的烴類物質主要通過三種方式進入微生物體內，即被動運輸，主動運輸和整批轉運[4]。Bateman 等[5]發(fā)現即使在細胞外基質中加入ATP 生成抑制劑，仍會順利被轉移到降解菌Pseudomona puidat 體內，因此認為通過簡單擴散方式進入微生物體內。Shishido [6] 的研究結果表明，苯酚在濃度低于50 mg·L-1 時以主動運輸方式進入降解菌體內，而在濃度較高時以被動運輸的方式進入微生物細胞內。Kennedy[7]認為細菌直接吸附在油滴上然后烴類通過擴散或主動運輸的方式進入菌株體內。Beal R[8]觀察到接種量高時PG201 對正十六烷的降解率低于接種量低時十六烷的降解率，從而推測這一現象與正十六烷的運輸方式有關。
Steinbuchel 和Ratledge[9-11]等人在研究中發(fā)現許多能降解烷烴類物質細菌在代謝過程中會產生不同的脂類物質，然后微生物將這些親脂性物質以特定的形式儲存在細胞內。文章在此基上，利用兩種高效石油降解菌DQ01 和DQ02 為對象，研究吸附在微生物表面的正十六烷以何種方式進入微生物體內，以及細胞內烷烴的存在形式。
2 材料和方法
2.1 實驗材料和儀器
無機鹽培養(yǎng)基（MSM）：5%KH2PO4，0.1%NH4Cl，0.02%MgSO4 7H2O，0.0015%CaCl2，1mL 微量元素/L 培養(yǎng)基(每100mL 溶液包含0.5mg CuSO4·5H2O，1.0mg H3BO3，1.0mgMnSO4·5H2O, 7.0mg ZnSO4)，去離子水定容到1000mL，115℃濕熱滅菌20min。
葡萄糖液體培養(yǎng)基：0.15%K2HPO4，0.02%MgSO4·7H2O，0.5%蛋白胨，1%葡萄糖，去離子水定容到1000mL，115℃濕熱滅菌20min。
正十六烷培養(yǎng)基：在無機鹽培養(yǎng)基中加入一定濃度的正十六烷。
儀器：Varian3800 氣相色譜儀（美國瓦里安技術有限公司），THZ-C 恒溫振蕩器（哈爾濱東聯公司），真空抽濾裝置（北京康林科技），J-25 型高速離心機（美國BECKMAN公司），JY96-Π 超聲波細胞粉碎機（寧波新芝公司），BX41 顯微鏡（OLYMPUS），120kVTecnai20 透射電子顯微鏡（FEI 香港有限公司），UV-240 紫外分光光度計（上海精密科學有限公司）。
2.2 實驗方法
2.2.1 菌種對不同濃度正十六的運輸富集試驗
將微生物在溫度為30℃的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中培養(yǎng)3d，然后4℃下儲存。細胞從固體培養(yǎng)基中接種到液體培養(yǎng)基中，30℃下培養(yǎng)過夜。移取5mL 培養(yǎng)液以6000r/min 離心5min，過濾掉上清液后，剩下的菌體用5mL 滅菌的無機鹽培養(yǎng)基（pH7.0）洗2 次，并以5mL 滅菌的無機鹽培養(yǎng)基重懸，以10％的體積比接種到無機鹽培養(yǎng)基中，加入一系列不同濃度（1、10、20、30、40、50、100 mg·L-1）的正十六烷，20min 后將培養(yǎng)液離心，菌體用無機鹽培養(yǎng)基清洗1 次，乙醇/丁醇/氯仿（體積比為10/10/1）清洗細胞2 次，再用滅菌的無機鹽培養(yǎng)基（pH7.0）洗2 次，以去除吸著在表面的烷烴。然后重懸于10mL 10mmol·L-1 的Tris-HCl(pH=7.5) 中，冰浴超聲破壁，每次3s 共60 次，每次間隔7s， 離心分離(7000r/min,10min)，上清液用等體積正己烷超聲萃取2 次。收集有機相，并用無水硫酸鈉脫水，在旋轉蒸發(fā)定容到1mL，用GC 測定濃度。富集的烷烴就是DQ01 和DQ02 體內烷烴的量。
2.2.2 菌種細胞內外正十六烷含量分析
這部分實驗是為了分析烷烴從細胞外進入細胞內是順濃度梯度還是逆濃度梯度。具體方法如下：微生物在溫度為30℃的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中培養(yǎng)3d，然后4℃下儲存。細胞從固體培養(yǎng)基中接種到液體培養(yǎng)基中，30℃下培養(yǎng)過夜。培養(yǎng)液以6000r/min 離心5min，然后菌體用5mL 滅菌的無機鹽培養(yǎng)基（pH7.0）洗2 次，以滅菌的無機鹽培養(yǎng)基重懸，以10％的體積比接種到一系列試管中，加入20 mg·L-1 十六烷，分別在1、2、5、10、15、20、30、40、60min 里將細菌離心，菌體用無機鹽培養(yǎng)基清洗1 次，乙醇/丁醇/氯仿（體積比為10/10/1）清洗細胞2 次，再用滅菌的無機鹽培養(yǎng)基（pH7.0）洗2 次，用GC 測定清洗溶液中的正十六烷，即為吸著在微生物表面的烷烴。細胞膜內烷烴富集量的分析見2.2.1。
2.2.3 NaN3 抑制條件下，菌種運輸富集正十六烷的試驗
微生物在溫度為30℃的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中培養(yǎng)3d，從固體培養(yǎng)基中接種到液體培養(yǎng)基中，30℃下培養(yǎng)過夜。培養(yǎng)液以6000r/min 離心5min，然后菌體用5mL 滅菌的無機鹽培養(yǎng)基（pH7.0）洗2 次，以滅菌的無機鹽培養(yǎng)基重懸，以10％的體積比接種到正十六烷培養(yǎng)基（DQ01 和DQ02 中正十六烷的濃度分別為20 mg·L-1）中， 30℃，150r/min 培養(yǎng)25min，其中8.5min 后加入30 mmol·L-1 的NaN3，分別在1min，4min，5 min，8min，10min，14min，18min，25min 取出5mL 細菌離心，菌體用無機鹽培養(yǎng)基清洗1 次，乙醇/丁醇/氯仿（體積比為10/10/1）清洗細胞2 次，再用滅菌的無機鹽培養(yǎng)基（pH7.0）洗2 次，以去除吸著在表面的烷烴，收集清洗液，測定上清中正十六烷的濃度變化。然后重懸于10mL 10mmol·L-1 的Tris-HCl(pH=7.5) 中，冰浴超聲破壁，每次3s 共60 次，每次間隔7s， 離心分離(7000r/min,10min)，上清液用等體積正己烷超聲萃取2 次。收集有機相，并用無水硫酸鈉脫水，在旋轉蒸發(fā)定容到1mL，用GC 測定菌種體內的濃度。
2.2.4 超薄切片的制備和微生物體內包涵體的觀察
參考 Preusting H [12]所用方法：將生長48h 的微生物離心后，倒去上清，2.5％戊二醛固定4h，PBS 緩沖液沖洗3 次，1％鋨酸固定2h，PBS 緩沖液沖洗3 次。然后分別用30%、50%、70%、80％、90％、95％、100％乙醇脫水，每次15min。將環(huán)氧丙烷與EPON812 樹脂按3?1 比例混合，放入樣品，靜置60min。將環(huán)氧丙烷與EPON812 樹脂按1?1 比例混合，放入樣品，靜置60min。將環(huán)氧丙烷與EPON812 樹脂按1?3 比例混合，放入樣品，靜置60min。將樣品放入EPON812 樹脂，靜置60min。將樣品用EPON812 樹脂包埋劑進行包埋，60℃下放置24h。將聚合好的包埋塊修塊、超薄切片，然后醋酸雙氧鈾染色30min，檸檬酸鉛染色30min，最后進行電鏡觀察。對電鏡內細胞中包涵體物的情況進行分析。對照是用葡萄糖培養(yǎng)基培養(yǎng)的2 種菌種在培養(yǎng)48h 后用上面的步驟處理。
2.2.5 GC 條件
采用 Varian3800 氣相色譜儀，色譜柱為HP-SE-54(30m，0.25mmid),載氣（N2）流速為16-20cm/s，進樣口分流比為60?1，進樣口溫度為250℃，FID 檢測器溫度為300℃，柱溫100℃保持2min，并以10℃/min 升溫到250℃保留10min。
3 結果與討論
3.1 不同正十六烷濃度對菌種運輸富集的影響
從圖可看出，蠟狀芽孢桿菌DQ01 和芽孢桿菌DQ02 體內富集正十六烷的含量隨初始培養(yǎng)液中正十六烷濃度的增加而增加，且在各個濃度水平上，DQ01 細胞內富集的正十六烷量高于DQ02 體內正十六烷的富集量，說明在實驗濃度范圍內，2 菌株細胞外正十六烷濃度的增大可以加大2 株菌對正十六烷的運輸富集。如當培養(yǎng)液中正十六烷初始濃度為20 mg·L-1時，20min 后，進入DQ01 細胞內的正十六烷濃度為2.76 mg·L-1，而當培養(yǎng)液中正十六烷初始濃度為40 mg·L-1 時，進入DQ01 細胞質中的正十六烷濃度為5.22 mg·L-1。原因為，正十六烷的濃度增大，加大了微生物對有機底物的接觸幾率，從而增加了進入細胞內的有機物的含量。但隨著初始正十六烷濃度的增加，細胞質中富集的正十六烷含量趨于穩(wěn)定，如正十六烷初始濃度分別大于50 mg·L-1 和30 mg·L-1 時，DQ01 和DQ02 細胞內富集的正十六烷增加緩慢，可見，正十六烷降解菌細胞膜內富集底物的能力與有機底物的初始濃度有關，這一現象與Kappeli.O 研究結果一致[13]。隨著培養(yǎng)液中正十六烷含量的增加，微生物DQ01 和DQ02并沒有表現出中毒性狀，2 株菌體內富集的烷烴量反而增加，這是因為微生物通過調節(jié)細胞膜的流動性和細胞膜中不同脂肪酸含量比例來適應毒性逐漸增加的環(huán)境，并發(fā)揮對有機底物的降解功能[14]。隨著培養(yǎng)液中烷烴含量的增加，細胞膜中順式和反式不飽和脂肪酸的比例降低，不飽和脂肪酸與飽和脂肪酸比例的增加都能增大細胞膜的流動性，從而彌補了有機物對微生物產生的毒性效應[15-16]，因此仍需深入分析DQ01 和DQ02 細胞膜中以及膜內不同脂肪酸的組成比例，從而更好地掌握微生物對烷烴的運輸機制。
3.2 菌種運輸富集正十六烷的機理分析
微生物能降解去除環(huán)境中的有害有機物，但對于微生物如何將這些有機物質運輸到體內，人們的認識還很有限。被動轉運是物質順濃度梯度進行的跨膜轉運方式，此過程不需消耗細胞本身代謝能，穿膜動力來自物質自身的熱運動或濃度差。主動轉運是通過消耗細胞自身代謝能進行的跨膜轉運，需要膜上專一性載體,其轉運速度一般比被動轉運要快很多，可以逆濃度梯度運輸，從而使生活在低基質環(huán)境中的微生物獲得營養(yǎng)[17]。
這部分實驗從細胞內外濃度差方面分析正十六烷的跨膜運輸方式。從圖2 可以看出，當培養(yǎng)液中正十六烷初始濃度為20 mg·L-1 時，在實驗階段吸附在DQ01 細胞表面的正十六烷濃度均小于被菌種運輸富集到體內的正十六烷濃度，如在第0-10min 這個時間段里，DQ01細胞表面吸附的烷烴量呈增大趨勢，并在第10min 達到吸附最大值1.10 mg·L-1，而DQ01 細胞內富集的烴濃度為2.72 mg·L-1，之后，細胞膜上吸附的烷烴量趨于穩(wěn)定，整個實驗階段，DQ01 以逆濃度梯度方式將正十六烷運輸到細菌體內。DQ02 運輸正十六烷的方式與DQ01不同，在實驗前10min，DQ02 細胞膜上吸附的正十六烷含量高于細胞內富集的烴含量，并在第10min 二者含量相同，均為2.01 mg·L-1，此后，DQ02 吸附的烷烴量開始下降，并低于細胞內富集的烷烴量。20min 后，DQ02 細胞膜上和體內富集的正十六烷含量趨于穩(wěn)定，因此DQ02 首先以順濃度梯度方式運輸烷烴，之后，以逆濃度梯度方式將烷烴運輸到菌種體內，即DQ02 先后通過被動擴散和主動運輸運過程將烷烴運輸到2 菌株體內。此外，DQ01 細胞膜上的烴含量明顯低于DQ02 細胞吸附的烴，分析其原因可能與降解菌膜內，膜周和胞外酶的降解能力不同有關[18]。蠟狀芽孢桿菌DQ01 的降解酶主要定域于膜周和膜內，且膜內酶的降解能力高于膜周酶，這種差別促使更多的十六烷以逆濃度梯度方式運輸到細胞內被降解；芽孢桿菌DQ02 的降解酶主要定域于胞外和膜內，且降解能力相同，所以細胞膜內外的烴濃度差不明顯。
3.3 NaN3 抑制條件下，菌種運輸富集正十六烷的規(guī)律
王紅旗[19]等人的研究表明加入正十六烷進入30 mmol·L-1 的NaN3 可使正十六烷在菌體內的富集量均減少80％以上，因此微生物運輸烷烴是需要能量的。這部分實驗選用能阻止細胞氧化磷酸化的NaN3 為抑制劑從而阻止ATP(三磷酸腺苷)的生成，如果加入合適濃度的NaN3 后菌種體內富集的正十六烷減少，則說明該菌種運輸正十六烷的方式是需要能量的，相反，如果加入的NaN3 并未影響菌種體內富集正十六烷，則說明這個過程是不需要能量的被動運輸過程。為進一步研究NaN3 抑制條件下不同時間內菌種主動運輸富集正十六烷的情況，分別在1min，4min，5min，8min，10min，14min，18min，25min 等一系列時間內測定菌和上清液中正十六烷的濃度變化（其中8.5min 后加入30 mmol·L-1 的NaN3），以過程中不加入NaN3 后測定的菌體內正十六烷濃度為對照。
如圖3a 和圖3b 所示，在8.5min 加入NaN3 之前，2 菌株體內運輸富集的正十六烷濃度略有增高，培養(yǎng)液中的正十六烷濃度基本不變，之后隨著抑制劑NaN3 的加入，2 菌株體內富集的正十六烷明顯下降，相應上清液中的正十六烷濃度則明顯增加。以DQ01 為例，在加入NaN3 時，細胞膜內正十六烷含量為3.12 mg·L-1，而在加入NaN3 的第10min,細菌體內正十六烷含量迅速降為1.54 mg·L-1，而對照組中細胞內正十六烷含量為3.17 mg·L-1，上清液中的正十六烷含量也由加入NaN3 前的16.54 mg·L-1 增加到18.52mg·L-1。結果表明，NaN3 抑制了DQ01 對正十六烷的主動運輸。發(fā)生這種變化的原因為，微生物細胞內，烴類物質的主動運輸和生物降解是同時發(fā)生的，但當主動運輸受阻時，進入到細胞內的底物減少，但存在于細胞內的烴被不斷生物降解，因此，加入NaN3 后，菌株體內富集的烴含量降低，細胞外又有烷烴不斷憎溶到水相中，因此上清液中烷烴含量會有所增加。相似的結果也在其它文獻中有報道。Aristeides K[20]的研究表明在培養(yǎng)液中加入能阻止ATP 生成的疊氮化鈉和2，4-二硝基苯酚都能使Arthrobacter sp. strain Sphe3 體內富集的菲含量。Whitman[21]等人發(fā)現P.
fluorescens 通過與能量有關的特殊運輸系統(tǒng)降攝入體內。只有經過引誘處理的降解菌Mycobacterium sp. strain RJGII-135 才能通過主動運輸方式攝取菲[22]。
3.4 細胞膜內包涵體的觀察
石油類物質作為基質通常需要由特定的、誘導性的運輸系統(tǒng)吸收到細胞內，這對石油的微生物降解尤其重要。那么，進入微生物體內的正十六烷又是以何種狀態(tài)存在的還需要進一步試驗分析。Kennedy[23]研究發(fā)現細菌Acinetobacter sp.在以正十六烷和正十七烷為唯一碳源時，體內均會出現明顯的包涵體，而在以非烴類化合物為碳源時，細菌體內沒有出現包涵體。
本次實驗用TEM 對2 株菌體內的包涵體進行了觀察，結果如圖4 和圖6 所示，以正十六烷為唯一碳源時，蠟狀芽孢桿菌DQ01 和芽孢桿菌DQ02 的菌種體內均出現了包涵體，但2 株菌中包涵體的形態(tài)不同差異，如圖4 所示，DQ01 體內的包涵體數目較多，呈透明、光滑的球狀，而DQ02 的包涵體不規(guī)則，并分散在菌種體內（如圖6）。而在以葡萄糖為唯一碳源時，2 株菌體內沒有發(fā)現包涵體（如圖5 和圖7），說明這些包涵體完全只與烴類的代謝有關，微生物通過未修飾烷烴的運輸作用把烷烴轉移到細胞內的烷烴氧化部位，所以出現了包涵體，這些包涵體的主要成分可能是中性脂質和未改變的正十六烷，并且由含有多種蛋白質的單分子層磷脂薄膜包圍[24-25]。但具體成分需要GC-MS 進一步分析。
Hector[26]等人發(fā)現在不同碳源培養(yǎng)基中，細菌Rhodococcus opacus strain PD630 體內會出現球狀和不規(guī)則狀包涵體，其形狀的不同與組成包涵體的脂類和親脂性化合物不同有關。
當Rhodococcus opacus strain PD630 以正構烷烴為基質時，其體內包涵體中的主要脂類物質為與基質含有相同碳原子數的烷鏈酸以及烷鏈酸；在以葡萄糖酸、乙酸和果糖為基質時，Rhodococcus opacus strain PD630 包涵體中的脂類物質主要是十六酸；而在以丙酸為基質時，組成包涵體的物質主要為奇數碳原子數的烷鏈烴，如十五烷和十七烷等。因此，需對DQ01和DQ02 體內包涵體中的組分進一步定性分析，從而揭示2 菌株對烷烴的富集機制。
4 結論
（1）微生物細胞內能富集正十六烷，且富集量隨時間有逐漸增大趨勢。不同濃度的正十六烷導致2 株菌對正十六烷的運輸富集量不同，在實驗范圍內，正十六烷的濃度增大可以加大2 株菌對正十六烷的運輸富集，但到一定濃度，細胞體內富集的正十六烷的量趨于穩(wěn)定。
（2） 在20min 的實驗周期內，DQ01 細胞膜上吸附的正十六烷含量低于體內富集的烷烴量，屬于逆濃度梯度運輸；而DQ02 細胞膜上吸附的正十六烷含量在前期高于體內富集的烷烴量，在后期呈相反狀態(tài)，說明DQ02 先后通過順濃度梯度和逆濃度梯度方式將烷烴運輸到體內。
（3）加入NaN3 之前 DQ01 體內運輸富集的正十六烷濃度略有增高，8.5min 加入NaN3后，菌種對正十六烷的運輸富集能力明顯下降，相應上清中的正十六烷濃度則明顯增加。在加入NaN3 之前芽孢桿菌DQ02 的體內正十六烷濃度基本處于穩(wěn)定水平，加入NaN3 后運輸富集到菌體內的正十六烷也立刻減少，表明在微生物運輸正十六烷的過程中是需能的，屬于主動運輸。
（4）以正十六烷為唯一碳源時，蠟狀芽孢桿菌DQ01 和芽孢桿菌DQ02 的菌種體內均出現了包涵體，而包涵體并沒有出現在以葡萄糖為碳源的2 株菌體內, 說明DQ01 和DQ02可以未加修飾地將烷烴運輸富集在體內的初始氧化部位。2 株菌中包涵體的形態(tài)存在一定差異，以正十六烷為唯一碳源時，DQ01 體內的包涵體數目較多，呈透明、光滑的球狀，而DQ02 的包涵體呈不規(guī)則狀，并分散在菌種體內。造成這一現象的原因可能與組成包涵體的脂類物質有關。
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