最新藥學專業畢業論文開題報告

時間：2024-09-10 03:27:43 開題報告

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　　畢業論文題目：梓醇對D-半乳糖擬老化神經元的作用研究

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　　背景介紹:

　　隨著世界人口中老年人比例和絕對數量的不斷攀升，由衰老引起的人口老化相關疾病的發病率明顯升高，與衰老相關的疾病已成為科學家面臨的一項重要挑戰。由于這類疾病常伴有嚴重的認知障礙及精神異常癥狀，甚至癱瘓和感覺障礙[1]，嚴重危害著老年人的健康，同時也給家庭、社會帶來了沉重的負擔。因此探討腦衰老機制，研究有效的延緩衰老進程的藥物，防治老年疾病己成為當今社會和醫藥學界研究的重大課題。

　　在諸多老年性疾病中，神經退行性疾病患病率逐年提高，已經成為影響人們健康水平和生活質量的重大社會問題。神經退行性疾病是中樞系統神經組織非正常退變引起的一類進行性功能缺陷與衰退疾病，如阿爾茨海默病(老年癡呆)，帕金森病，肌萎縮側索硬化癥，亨廷頓氏舞蹈癥等[2-4]。其中，老年癡呆的患病率占老年人口的4.6%，其中半數為老年原發性退行性癡呆。流行病學調查也顯示，在65歲以上的人群中，老年原發性退行性癡呆的發病率達2.9%。該病具有復雜的病理生理過程，受基因調控和多種環境因素影響，是一類病因學和發病機制還不清楚的疾病。臨床上,對于這類疾病尚無有效控制病程進展的措施,患者最終將喪失生活能力甚至死亡。目前，我國人口老化速度居世界之首，老年人口已超過1億，因此尋求有效的預防和治療衰老疾病的藥物迫在眉睫。

　　我國中藥有著悠久的歷史，良好的治療效果，是中華民族傳統文化的燦爛瑰寶，在幾千年的實踐發展中，已形成了自己獨特的理論體系。特別是針對疑難病和慢性病，中醫藥更有它的獨到之處。中藥具有多靶點多效性特點，既可改善癥狀以治標，又可提高機體抗病能力以治本，而且副作用較少、藥源豐富。中醫在治療老年性癡呆與記憶減退的數千年臨床經驗中積累了許多寶貴的知識。自20世紀80年代以來，由于化學藥品開發所存在的技術難度高、價格昂貴、毒副作用明顯和環境污染嚴重等實際問題，傳統中醫藥的研究受到了廣泛的關注。

　　地黃是常用的補益中藥，為玄參科植物地黃Rehmannia glutinosa Libsch的新鮮根莖或干燥塊根，始載于《神農本草經》，被列為上品[5]。地黃在我國有1000多年的藥用歷史，應用十分廣泛，對免疫、血液、內分泌、心腦血管、神經系統及抗菌、抗炎等方面均有一定的作用[6]。單味地黃[7]和以地黃為主的復方在衰老及其相關疾病治療中的應用歷史也十分久遠。現代藥理學實驗發現其主要的活性組分為環醚苷類和地黃糖類。

　　梓醇是地黃中含量最高的的環醚苷類，屬于環氧醚型單類化合物。目前本實驗室分別在細胞和動物水平上證明了梓醇具有神經保護作用，可能是潛在的延緩衰老和治療神經退行性疾病如老年癡呆、帕金森疾病的藥物。由于衰老是各種神經退行性疾病發生的根本要素，研究梓醇的抗衰老作用對預防和治療該類疾病具有重要意義[8-9]。

　　實驗前期發現梓醇具有改善D-半乳糖致衰老模型小鼠記憶減退的功效，同時能提高腦組織抗氧化能力和能量代謝障礙,因此本研究利用D-半乳糖引起神經元老化的模型進一步研究梓醇抗衰老的作用機制，為該藥的開發和臨床應用奠定一定的基礎。

　　研究意義:

　　1、D-半乳糖致衰老神經細胞模型鮮見報道，明確該模型作用機制有助于利用此模型進行抗衰老藥物的篩選和機理研究。

　　2、梓醇在衰老動物模型上的效果明顯，利用細胞模型的研究有助于闡明梓醇抗衰老作用的分子作用機制。

　　研究內容:

　　采用小鼠腦神經元細胞原代培養,以D-半乳糖誘導體外神經元細胞衰老,并通過研究藥物梓醇的加入對神經元細胞的作用,進行細胞形態學觀察、細胞活力、細胞凋亡等綜合指標的測定。

　　實驗過程中應用細胞免疫組化染色和熒光染色技術、流式細胞儀、熒光顯微鏡、紫外分光光度計、熒光酶標儀等方法手段，研究梓醇在體外的神經保護作用機制。

　　預期達到的成果和水平:梓醇對D-半乳糖引起的小鼠腦神經元細胞衰老有保護作用.

　　因此本課題擬利用原代培養SD大鼠乳鼠腦皮層神經細胞，從超微結構、細胞周期分析及SA-β-半乳糖苷酶(Senescence associated β-galactosidase)化學染色等指標觀察D-半乳糖培養對神經元擬老化反應并從生化方面研究梓醇的抗老化作用。

　　研究重點難點:

　　1、掌握原代神經元細胞的培養、免疫組織化學等實驗技術。

　　2、明確D-半乳糖致神經元衰老的作用濃度和作用時間范圍。

　　3、初步研究D-半乳糖致神經元衰老的作用機理。

　　4、明確梓醇對D-半乳糖致衰老神經元的作用效果。

　　課題名稱 HPLC法測定伏立諾他有關物質和含量的研究

　　[研究的主要目的和意義]

　　vorinostat (商品名Zolinza) 是Merck 公司開發的世界上第一個抑制組蛋白脫乙酰基酶( his2tone deacetylase ,HDAC) 的新型抗癌藥物,該藥于2006 年10 月6 日獲得美國FDA 批準上市,用于其他藥物治療時或治療后仍不能治愈、或惡化、或病情反復情況下的轉移性皮膚T 淋巴細胞瘤。vorinostat 化學名: N-羥基-N苯基辛二酰胺;英文名: N-hydroxy-N-phenyloctane-diamide

　　vorinostat 屬于組蛋白去乙酰化酶抑制劑類抗腫瘤藥物,低濃度( IC50 < 86 nmol·L - 1) 即可以有效抑制組蛋白脫乙酰酶HDAC1 、HDAC2 、HDAC3 和HDAC6 的活性,抑制組蛋白次乙酰化,因而從基因水平調控細胞周期,阻斷癌細胞基因復制,并激活其凋亡基因,達到抑制和殺滅癌細胞的效果。但vorinostat 的抗癌機制仍在深入研究之中,其具體作用機制尚不完全清楚[6 - 7 ] 。兩項臨床試驗證明了vorinostat 的安全性和有效性,其中包括107 名接受其他藥物治療后又復發的CTCL 患者。按皮膚損傷改善標準評分等級的判斷,接受Zolinza 治療的患者中30 %有所改善,療效平均持續168 d。

　　一些生物學數據已經證明了vorinostat 在皮膚癌，前列腺癌治療中的有效性。而且近年研究vorinostat 不僅可以單獨作為腫瘤治療藥物,還可以與其它抗癌藥物聯合用藥, 減少對正常細胞的毒性,具有增效作用。可與轉錄調節因子(如52 雜氮22′2 脫氧胞苷、視黃酸、mRNA 轉錄抑制劑flavopiridol)[51- 53] 、凋亡受體配體(如阿霉素、長春新堿、依托泊苷、多紫杉醇)[54- 56]、化療藥物(如抗代謝藥吉西他賓、全反式維甲酸) [57,58]以及激酶抑制劑、放射線等聯合用藥。近年來研究發現vorinostat

　　還可影響到有絲分裂、DNA 復制和修復以及調控非組蛋白的蛋白質乙酰化程度。但是該藥用于臨床治療癌癥仍然需要解決一些問題如: 抑制劑對HDAC 酶系的選擇識別作用、選擇最佳藥用劑量、治療周期以及尋找更多可以促進這種藥抑制作用的物質等。毋庸置疑,隨著對HDACIs 抗癌機理的深入研究,vorinostat 將會有廣闊的應用前景。

　　伏諾立他目前在國內還沒有上市，我們準備仿制該品種，建立該藥的質量標準，用建立的標準對原料和制劑進行有關物質和主藥含量進行研究。

　　[采用的研究手段及文獻綜述]

　　根據破壞試驗的結果，結合伏立諾他合成工藝，建立伏立諾他有關物質檢查方法，并對其進行方法學驗證。

　　1.儀器與藥品

　　Waters 996光電二極管陣列檢測器，Waters Empower色譜工作站，試藥及其中間體均由南京海納醫藥科技公司提供

　　2. 色譜條件的建立

　　2.1檢測波長的選擇

　　取伏立諾他適量,用流動相制成每1ml含15μg的溶液,照分光光度法(中國藥典2005年版二部附錄Ⅳ A)在200～400 nm波長范圍內掃描測定

　　2.2系統使用性試驗

　　色譜柱:Diamonsil C18 ( 250 mm ×4. 6 mm, 5μm)色譜柱為分析柱;乙腈- 0.1%磷酸溶液(三乙胺調PH3.0)為流動相，不斷調節流動相比例，梯度洗脫，流速為1.0 ml ·min- 1 , 檢測波長為241nm, 柱溫30℃, 進樣量: 20μl。

　　根據合成工藝,伏諾立他成藥中可能引入一系列的合成中間體及原料還有雜質，取本品可能帶入的雜質、中間體分別加流動相適量溶解;另取雜質中間體及伏立諾他適量,用流動相制成適宜濃度的溶液,精密

　　吸取雜質，中間體與吡非尼酮混合溶液各20 μl,分別進樣，考察分離度，理論塔板數，及拖尾因子，再根據具體條件進行調整，選出最適合的條件。

　　2.3專屬性試驗

　　取供試品,進行高溫、光照、酸、堿、氧化破壞試驗。

　　熱降解溶液的配制:取本品20 mg,置25 ml量瓶中,置140℃高溫4 h后,用流動相溶解并稀釋至刻度; 光降解溶液的配制:取本品20 mg,置25 ml量瓶中,用流動相制成每1 ml含吡非尼酮0. 8 mg的溶液,置紫外燈光下48 h;

　　酸降解溶液的配制:取本品20 mg,置25 ml量瓶中,加2mol·L - 1鹽酸溶液5 ml,放置4 h,用2 mol·L - 1氫氧化鈉溶液調至中性,加流動相稀釋定容;

　　堿降解溶液的配制:取本品20 mg,置25 ml量瓶中,加2mol·L - 1氫氧化鈉溶液放置4 h,溶液顏色變黃,另加2 mol·L - 1鹽酸溶液調至中性,加流動相稀釋定容;

　　氧化破壞溶液的配制:取本品20 mg,置25 ml量瓶中,加過氧化氫5 ml,避光放置4 h,用流動相稀釋定容。照高效液相色譜法,取上述各溶液各20μl進樣,記錄結果，進行分析

　　2.4線性范圍：

　　精密稱取伏立諾他對照品約15 mg,置50ml量瓶中,加流動相溶解并稀釋至刻度,搖勻,作為貯備液。分別精密量取貯備液1、2、3、4、5 ml置10 ml量瓶中,加流動相稀釋至刻度,搖勻。分別取溶液20μl分別注入色譜儀,記錄色譜圖,量取峰面積,由溶液濃度(C) 對峰面積(A)線性回歸。

　　2.5檢測限：取空白基線一段,計算其噪音峰高,再將伏立諾他樣品溶液用流動相稀釋適當濃度進樣,使其峰高為噪音峰高的3倍,記錄檢測限。

　　2.6精密度試驗

　　2.6.1 進樣精密度：取標準曲線項下高、中、低三種濃度的溶液,分別重復進樣5 次,以峰面積來考察精密度。

　　2.6.2中間精密度：選擇不同人員,分別測定同一批樣品的含量。

　　2.7重復性試驗：分別取同一批樣品, 6份,精密稱定,照樣品測定項下操作,計算含量。

　　2.8穩定性試驗：照標準曲線項下的方法配制高、中、低三種濃度的溶液,分別于0、1、2、4、6、8 h測定。考察其穩定性

　　2.9含量測定：取本品適量,精密稱定,用流動相制成每1ml含50μg的溶液,作為供試品溶液,精密量取20μl,注入液相色譜儀,記錄色譜圖,量取峰面積;另取經干燥至恒重的伏立諾他對照品適量,同法測定,按外標法以峰面積計算,即得。

　　2.10有關物質測定：取本品適量,精密稱定,用流動相制成每1 ml含0.5mg的溶液,作為供試品溶液;精密量取供試品溶液1 ml,置100 ml量瓶中,用流動相稀釋至刻度,搖勻,作為對照溶液。精密量取對照溶液20μl,注入液相色譜儀,調節檢測靈敏度,使主成分色譜峰的峰高為滿量程的10% ～25%;再精密量取供試品溶液和對照溶液各20μl,分別注入液相色譜儀,記錄色譜圖至主成分峰保留時間的4倍。供試品溶液色譜圖中如有雜質峰,最大單個雜質峰面積不得大于對照溶液主峰面積的1 /2 ( 0.5% ) ,各雜質峰面積總和,不得大于對照溶液主峰面積( 1% )。

　　參考文獻：

　　【1】胡楊，陳國華，吳燕，楊尚彥.伏諾立他的合成[J].中國醫藥工業雜志，2009，40(7)：481-482.

　　【2】黃小平，徐江. 組蛋白去乙酰化酶抑制劑類抗癌藥Vorinostat[J].化工中間體，2009，06：11-13.

　　【3】Sakajiri S, Kumagai T, Kawamata N, et al. Histone deacetylase inhibitors profoundly decrease proliferation of human lymphoid cancer cell lines [J]. Exp Hematol, 2005,33(1): 53-61.

　　【4】Robert A.Parise, Julianne L.Holleran, Jan H.Beumera, Suresh Ramalingama, Merrill J. Egorin. A liquid chromatography–electrospray ionization tandem mass spectrometric assay for quantitation of the histone deacetylase inhibitor, vorinostat (suberoylanilide hydroxamicacid, SAHA),and its metabolites in human serum[J]. Chromatography B, 840 (2006) 108

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