醫學生物學克隆論文
克隆是指生物體通過體細胞進行的無性繁殖，以及由無性繁殖形成的基因型完全相同的后代個體組成的種群。下面是我整理的關于醫學生物學克隆論文，僅供參考!
1結果與分析
1.1小桐子JcMSRA基因全長cDNA的克隆以小桐子葉片材料提取總RNA，并反轉錄cDNA為模板，擴增JcMSRA基因cDNA全長序列。結果表明，擴增得到的產物約0.9kb(圖1A)。將目的條帶切膠回收后與T/A克隆載體pEASY-T1連接，轉化大腸桿菌，菌落PCR驗證陽性克隆(圖1B)。挑取陽性克隆過夜搖菌，提取重組質粒pEASY-T1-JcMSRA(圖1C)，并以M13通用引物進行測序。
1.2小桐子JcMSRA基因的生物信息學分析經測序分析，本研究克隆的小桐子JcMSRA基因的cDNA序列全長879bp，包含一個完整的開放閱讀框(780bp)，編碼259個氨基酸(圖2)。通過將JcMSRA編碼框與其基因組序列(Jcr4S03665,14648~16350位,1702bp)比對，發現JcMSRA基因包含2個外顯子(長度分別為528bp與252bp)與1個內含子，且內含子的序列(924bp)較2個外顯子都長，符合AT/GT的剪切規則。ProtParam分析結果顯示，JcMSRA編碼的蛋白質分子量為29.1kD，理論等電點為8.75，且單體亞基不穩定，說明其屬于多聚體蛋白質。
另外，該蛋白質N端不含信號肽，預測其亞細胞定位可能性最大的為線粒體、其次為細胞核。ExPASy的COILS預測發現，該蛋白質在190~220位有一個明顯的卷曲螺旋區域(圖3A)。作為一種超二級結構，卷曲螺旋一般由2~7個短的琢-螺旋組成，是許多轉錄因子與功能蛋白質的結構元件，該卷曲螺旋出現的位置正好是其二級結構中琢-螺旋最長的部位，與SOPM服務器預測的結構吻合(圖3B)。分別以大腸桿菌(Escherichiacoli)、釀酒酵母(Sa-ccharomycescerevisiae)、萊茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)、擬南芥(Arabidopsisthaliana)、蒺藜苜蓿(Medicatruncatula)、毛果楊(Populustrichocarpa)、家鼠(Musmusculus)、人(Homosapiens)與小桐子MSRA氨基酸序列進行多重序列比對(圖4)，發現MSRA氨基酸序列在N端與C端都沒有同源性，差異變化較大，而在中部相對保守。
MSRA屬于單結構域蛋白，位于該酶蛋白活性中心的核心氨基酸殘基為Phe102、Trp103、Tyr132、Glu144、Tyr184(圖4,菱形標注)，而-GCF-W-保守序列的Cys與C端的兩個保守Cys殘基主要起維持酶活性中心結構的功能。將小桐子MSRA氨基酸序列進一步與MSR家族的三類不同(MSRA,MSRB,fRMSR)的MSR氨基酸序列進行多重序列比對，并構建系統進化樹(圖5)。由圖中可以看出，不同的MSR被聚類為明顯的三條分支，印證了MSR三個家族在氨基酸一級序列及高級結構等方面的進化差異性。我們得到的小桐子MSR被歸入了MSRA分支中，與小桐子的近科物種毛果楊(Populustrichocarpa)在進化上距離較遠，序列相似性僅為22.19%，而與蕓豆(Phaseolusvulgaris)、棉花(ssypiumbarbadense)、油菜(Brassicanapus)、擬南芥(Arabidopsisthaliana)的親緣關系較近，序列相似性分別為70.30%、68.82%、61.65%、60%。目前，通過X-晶體射線衍射法已經獲得了幾種(如大腸桿菌,毛果楊,牛)MSRA的高分辨率三維結構。我們通過同源建模方法構建了小桐子MSRA的三維空間結構并進行了氨基酸殘基能量評估(圖6)。綜合研究MSRA的晶體結構顯示，其表面都有一個口袋狀結構，且該結構周圍的氨基酸殘基相對保守，后被證實是底物甲硫氨酸亞砜的結合位點。小桐子MSRA蛋白的底物結合位點氨基酸構成為Tyr132、Glu144、Tyr184，另外，-GCFW-保守序列中的最后兩位氨基酸Phe102、Trp103也參與了催化中心的形成(圖6A)，而-GCFW-保守序列結構域中的Cys101以及C端的保守Cys251、Cys257在維持結合位點空間結構方面也是不可或缺的。
Ramachandram能量圖分析顯示有96.9%的氨基酸殘基處于能量穩定區域，說明預測的三維結構可信(圖6B)。小桐子MSRA空間結構核心區域是3段琢-螺旋包裹的6條茁-折疊片層結構，呈現琢/茁卷狀，二級結構組成順序以茁1-琢1-茁2-茁3-琢2-茁4-琢3-茁5-茁6排列，并且茁1與茁6較短，而核心4條茁-折疊較長，在拓撲結構上排列為反平行方式。另外，在茁2與茁3之間有1段極短的琢-螺旋，在琢2與茁4之間存在2條反平行的極短茁-折疊與1段極短琢-螺旋，而在靠近N末端還存在1段極短琢-螺旋，C端存在2段極短琢-螺旋。蛋白質核心區域被兩端柔性區包裹，包括N端的92個氨基酸殘基(Met1-Glu92)與C端的33個氨基酸殘基(Ala227-Gly259)。
2討論
甲硫氨酸亞砜還原酶作為生物體內的抗氧化修復因子屬于多基因家族，目前已經報道的甲硫氨酸亞砜還原酶有三個亞家族，不同家族雖然催化相似的反應，但沒有一級氨基酸序列及三維結構相似性(Rouhieretal.,2006)。最早被報道的兩個亞家族是MSRA與MSRB，MSRA與MSRB能夠分別特異性地還原Met-S-SO與Met-R-SO，且兩者既可以催化游離的甲硫氨酸亞砜，也可以催化蛋白表面的甲硫氨酸亞砜。第三個MSR家族最早在大腸桿菌中發現，命名為fRMSR(freemethionine-R-sulfoxidereductase)，而該酶只能催化游離的甲硫氨酸亞砜。
MSRA最早從大腸桿菌中分離出來的，是一類相對較小的胞質酶，編碼該酶蛋白的基因廣泛存在于生物界，如梭狀芽孢菌(Clostridiumsp.Ohilas)、金屬還原菌(Shewanellaoneidensis)、嗜熱古生菌(T.kod-akaraensis)、酵母菌、擬南芥、楊樹、果蠅、小鼠、大鼠及人。該亞家族不同種屬間同源性不高，但其催化部位的氨基酸序列是非常保守的。在N端存在一個保守序列-GCFWG-(尤其是中心的Cys)，這一序列的突變將導致MSRA完全失活；另外，在C端存在兩個保守的還原型Cys殘基，以上三個保守的Cys在空間結構上共同參與MSRA催化中心的構成(Rouhieretal.,2007)。MSRB最初也是從大腸桿菌中發現的，且在黃單孢菌(Xanthomonascampestris)、梭狀芽孢菌(Clostriidiumsp.Ohila)、擬南芥、煙草、果蠅及人等生物體中都存在，屬多基因亞家族，在不同生物體(如人,小鼠等)中一般都有3個MSRB，主要定位于內質網與線粒體，其N端定位信號肽在不同的MSRB中較為保守。MSRB在其N端同樣存在-GCGWP-保守序列，除此之外，大部分MSRB在其C端僅存在一個保守的Cys殘基(Dingetal.,2007)。與MSRA不同，MSRB中還包含兩個-CXXC-保守序列，用于結合Zn2+或Fe2+，共同構成MSRB的活性中心(Olryetal.,2005)。
目前關于MSRA與MSRB的表達、調控及作用機理的研究主要集中在微生物及動物中，如大腸桿菌、酵母菌、小鼠及人等，而對于植物MSR的研究報道近幾年才逐漸增多，本研究中克隆的小桐子MSRA基因也是首次報道。研究發現，擬南芥中至少存在5個編碼不同形式的MSRA基因AtMSRA1-At-MSRA5，同時存在至少9個MSRB基因AtMSRB1-AtMSRB9；另外，在毛白楊中發現9個MSR基因，包括5個MSRA與4個MSRB；在水稻中發現4個MSRA與3個MSRB基因。利用在線軟件預測發現，不同的MSR在植物細胞中有不同的定位，目前發現的包括細胞質、葉綠體、線粒體、內質網及分泌型MSR等(Rouhieretal.,2007)。芯片數據與轉錄組數據都表明不同亞細胞定位的MSR有著不同的組織表達模式，胞質型MSR通常在所有組織器官中都有表達，葉綠體型MSR主要在綠色組織尤其是葉中表達。
Romero等(2004)通過RT-PCR分析了擬南芥不同MSR類型的組織表達特異性，結果表明，AtMRA4在除根以外的所有組織中的表達量都很豐富，其總表達量在所有MSRA中也是最高的；AtMSRA2和AtMSRA3表達量僅次于AtMSRA4，且主要在根和莖中表達；而AtMSRA1和AtMSRA5在所有組織中的表達量都很少；AtMSRB2、AtMSRB6的表達量在葉和其它綠色部位中最高，而AtMSRB5、AtMSRB7、AtMS-RB8、AtMSRB9則主要在根中高表達。大量數據表明，各種生物與非生物脅迫可以誘導高等植物不同MSR基因的表達，強光與鹽脅迫可以強烈誘導擬南芥質體型AtMSRA4的表達(Gustavssonetal.,2002)。定位在內質網中的AtMSRB3可清除在植物受冷脅迫時內質網中積累的MetSO和ROS，過表達AtMSR-B3可以提高擬南芥植株的耐寒性(Kwonetal.,2007)。而水稻OsMSRB1.1在受到包括鹽、甘露醇、低溫、甲基紫精和ABA在內的非生物脅迫時表達量上升，而高溫處理則會使OsMSRB1.1表達量下降(Guoetal.,2009)。以上事實說明MSR基因表達種類的多樣性與組織特異性、表達調控的復雜性以及與植物應答逆境脅迫的關聯性，同時也暗示其在植物抗逆性研究中的應用前景。
3材料與方法
3.1實驗材料及處理供試小桐子種子采自云南省楚雄州元謀縣。選取飽滿的小桐子種子，用1.5%CuSO4消毒20min，無菌水漂洗5次，于26℃的恒溫培養箱中吸漲24h(李忠光和龔明,2010)。將吸漲的種子在無菌水中漂洗3次，播于墊有5層用無菌水濕潤濾紙的白磁盤(24cm伊16cm)中，于相對濕度75%、晝夜溫度26/20℃、光周期16/8h的恒溫培養箱中萌發5d。之后將發芽的種子播于消毒的培養土中并于同樣恒溫培養箱中培養15d至第二片真葉展開。取第二片真葉材料，液氮速凍后置于-80℃冰箱中用于RNA的提取。
3.2菌株與主要試劑大腸桿菌Trans1-T1(DH5琢)菌株由本實驗室保存；TransZolUp、DNase玉、TransStartTaqDNAPoly-merase、Amp、X-gal、IPTG、2伊EasyTaqPCRSuperMix(+dye)、TransScriptTwo-StepRT-PCRSuperMix、EasyPureQuickGelExtractionKit、EasyPurePlasmidMin-iPrepKit、pEASY-T1CloningKit、Trans2KPlus域DNAMarker購自全式金生物技術有限公司；引物合成和測序由深圳華大基因有限公司完成。
3.3實驗方法
3.3.1總RNA的提取及cDNA第一鏈的合成取0.2g小桐子葉片材料，按照王海波等(2014)的方法利用TransZolUp試劑提取并純化總RNA。以AnchedOli(dT)18為逆轉錄引物，利用TransScriptTwo-StepRT-PCRSuperMix合成第一鏈cDNA。
3.3.2小桐子JcMSRA基因全長cDNA的克隆以擬南芥MSRA全長mRNA序列(XM_002510-827.1)為種子序列，對我們高通量測序得到的小桐子低溫鍛煉轉錄組(GenBank登錄號:GAHK00000000.1)的45251條Unigenes進行本地Blast，得到小桐子MSRA基因的序列Unigene850_JC-CK_1A(GAHK0-1013398,1714bp)。序列分析表明其包含全長F(780bp)。以此序列為基礎設計全長cDNA克隆引物，并送深圳華大基因合成。引物序列為：上游F(5''''-ACACAACTTAACTCAACACGTCA-3'''')；下游R(5''''-AACCCAGCAAACTGTATAAAAAC-3'''')。以3.3.1中反轉錄cDNA模板，使用TransStartTaqDNAPolymerase進行PCR擴增，擴增條件為：94℃5min寅[94℃30s,54.9℃30s,72℃1min]35寅72℃20min。擴增完成后用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，利用EasyPureQuickGelExtractionKit從瓊脂糖凝膠中回收目的基因片段(879bp)，并與克隆載體pEASY-T1連接，轉化大腸桿菌Trans1-T1感受態細胞，涂LB抗性平板(LB-Amp垣IPTG垣X-gal)，過夜生長，挑取白斑菌落進行菌落PCR鑒定。陽性克隆取名為pEASY-T1-JcMSRA，并送深圳華大公司利用pEASY-T1質粒上的M13F與M13R通用引物進行雙向測序。
3.3.3小桐子JcMSRA基因的生物信息學分析利用Spidey軟件進行克隆cDNA序列與基因組序列比對以確定JcMSRA基因內含子與外顯子的結構。利用BioEdit軟件將JcMSRAcDNA序列翻譯成氨基酸序列，利用在線工具ProtParam計算蛋白質的理論分子量、等電點等基本參數。利用WolfSpt在線軟件對蛋白質進行亞細胞定位預測，并利用SignalP3.0Server分析蛋白質信號肽序列，接著利用在線工具TMHMM與Proscale檢測其跨膜結構與親水/疏水特性。分別利用SOPM與ExPASy的COILS軟件分析其二級結構與卷曲螺旋結構。利用NCBICDD工具進行結構域與功能元件的鑒定。從Gen-Bank下載其它物種MSR氨基酸序列，利用ClustalX進行序列相似性比對，然后用MEGA4.0軟件通過鄰接法構建系統進化樹，并采用泊松法進行檢驗。利用Phyre2進行蛋白質三維結構的同源建模，利用VMD軟件顯示其三維空間結構，并結合Ramachandram圖驗證模型的準確性。
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