有關藥用植物代謝組學的研究進展
摘要：從技術步驟、分析方法以及實際應用三個方面對當前藥用植物代謝組學研究領域的一些理論問題和實踐中面臨的挑戰進行綜述。關鍵詞： 藥用植物；代謝組學；功能基因組學
代謝組學是對生物體內代謝物進行大規模分析的一項技術［1］，它是系統生物學的重要組成部分（如圖1所示），藥用植物代謝組學主要研究外界因素變化對植物所造成的影響，如氣候變化、營養脅迫、生物脅迫，以及基因的突變和重組等引起的微小變化，是物種表型分析最強有力的工具之一。在現代中藥研究中，代謝組學在藥物有效性和安全性、中藥資源和質量控制研究等方面具有重要理論意義和應用價值。另外，在對模式植物突變體文庫或轉基因文庫進行分析之前，代謝組學往往是首先考慮采用的研究方法之一。目前，國外已有成功利用代謝組學技術對擬南芥突變株進行大規模基因篩選的例子，這為與重要性狀相關基因功能的闡明和選育可供商業化利用的轉基因作物奠定了基礎。
圖1系統生物學研究的四個層次 略
目前，還有許多經濟作物的全基因組測序計劃尚未完成，由于代謝組學研究并不要求對基因組信息的了解，所以在與這些作物有關的研究領域具有更大的利用價值，這也是其與轉錄組學和蛋白組學研究相比的優勢之一。代謝組學研究涉及與生物技術、分析化學、有機化學、化學計量學和信息學相關的大量知識，Fiehn［2］對代謝組學有關的研究方向進行了分類（見表1）。
1代謝組學研究的技術步驟
代謝組學研究涉及的技術步驟主要包括植物栽培、樣本制備、衍生化、分離純化和數據分析5個方面（見圖2）。
1.1植物栽培
對研究對象進行培育的目的是為了對樣本的穩定性進行控制，相對于微生物和動物而言，植物的人工栽培需要考
表1代謝組學的分類及定義 略
慮更多的問題，如中藥材在不同年齡、不同發育階段、不同部位以及光照、水肥、耕作等環境因素的微小差異都可引起生理狀態的變化，而這些非可控及可控雙重因素的影響很難進行精確的控制，從而影響藥用植物代謝組研究的重復性。為了解決以上問題，推薦使用大容量的培養箱［3］，定時更換培養箱中栽培對象的位置，以及使用無土栽培技術等，Fukusaki E［4］利用無土栽培系統將水和養分直接引入植物根部，并且對供給量進行精確地控制，大大提高了實驗的重復性。
1.2樣本制備
為了獲得穩定的實驗結果，樣本制備需要考慮樣本的生長、取樣的時間和地點、取樣量以及樣本的處理方法等問題，并根據分析對象的分子結構、溶解性、極性等理化性質及其相對含量大小對提取和分離的方法進行選擇，逐一優化試驗方案。Maharjan RP等［5］用6種方法分別對大腸桿菌中代謝產物進行提取，發現用－40℃甲醇進行提取的效果最好。現階段代謝組學的分析對象主要集中在親水性小分子，尤其是初級代謝產物，氣相色譜?質譜聯用(GC?MS)和毛細管電泳?質譜（CE?MS）聯用都是分析親水小分子的重要技術。Fiehn O等［6］使用GC?MS對擬南芥葉片中的親水小分子進行了分析，發現酒石酸半縮醛、檸蘋酸、別蘇氨酸、羥基乙酸等15種植物代謝物。
1.3衍生化處理
對目標代謝產物的衍生化處理取決于所使用的分析設備，GC?MS系統只適合對揮發性成分進行分析，高效液相色譜法（HPLC）一般則使用紫外或熒光標記的方法對樣本進行衍生處理，Blau K［7］對酯化、酰化、烷基化、硅烷化、硼烷化、環化和離子化等衍生方法進行了詳細的說明。然而離子化抑制常使得質譜分析過程中目標代謝產物的離子化效率降低，這主要是由于分離過程中污染物與目標代謝物難以完全分離開所引起的，優化色譜分離時間可有效緩解離子化抑制，然而在實際操作中不可能對上百種代謝產物的分離時間進行優化，利用非放射性同位素稀釋法進行相對定量可以很好的解決該問題。Han DK等［8］應用同位素編碼的親和標記（ICAT），根據經誘導分化的微粒蛋白及其同位素標記物的峰面積比，對該蛋白的相對含量進行分析。Zhang R等［9］發現同位素標記技術也可用于代謝組學的研究，但是卻存在許多困難。活體的同位素標記方法對于同位素的洗脫是一種非常有潛力的技術，目前關于使用34 s的研究已有報道［10］。
圖2代謝組學研究技術步驟 略
1.4分離和定量
分離是代謝組學研究中的重要步驟，與質譜聯用的色譜和電泳分析技術都是使用紫外或電化學檢測的方法進行定量，其對代謝組數據的分辨率與定量能力都有一定的影響。Tomita M等［11］總結了各種色譜分離法中經常遇到的技術問題，認為毛細管電泳和氣相色譜法由于具有較高的分辨率，已成為代謝組學研究的常規技術手段之一，液相色譜因其適用范圍廣，應用也相當廣泛。
Tanaka N等［12］用高效液相色譜對樣品進行分離，認為使用硅膠基質填充毛細管整體柱的高效液相色譜系統具有用量少、靈敏性高、低壓降高速分離等優勢；同時，Tolstikov V等［13］也使用硅膠填充的毛細管液相色譜方法對聚戊醇類異構體進行了有效分離，獲得了很好的分辨率。Tanaka N等［14］發現二維毛細管液相色譜法的分辨率比傳統的高效液相法高10倍。相對于其他色譜方法而言，超臨界流體色譜（SFC）是分離疏水代謝物最具潛力的技術之一，特別適用于分離那些傳統HPLC難以分析的疏水聚合物，Bamba T等［15］通過SFC對聚戊醇進行分析，證明其具有較好的分離能力。針對質譜中存在的共洗脫現象，Halket JM等［16］發明了一種適用于GC?MS的反褶積系統，對共洗脫的代謝產物進行分離與識別。Aharoni A等［17］使用傅立葉變換離子回旋共振質譜（FT?ICR?MS）對非目標代謝物進行分析，快速掃描植物突變樣品，獲得了一定量的代謝成分。
與分離一樣，定量能力也是代謝組學研究中的重要因素，其取決于各分析系統的線性范圍。傅立葉轉換核磁共振（FT?NMR)、傅立葉紅外光譜（FT?IR）以及近場紅外光譜法（NIR）等技術由于敏感性低，重復性受共洗脫現象影響較小也被用于檢測中。近年來，FT?NMR技術常被用于植物代謝組的指紋圖譜研究 ［18］，但由于NMR分析需要樣品量較大，分析結果易受污染，Griffin J L ［19］發現將統計模式識別與FT?NMR相結合可以對代謝物進行全面分析。除FT?NMR之外，FT?IR通過對有機成分的結構進行常規光譜測定，也可適用于代謝組學的研究，特別是應用于構建代謝組學的指紋
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