淺析非病毒載體基因轉移技術的現狀和展望
摘要：目前基因治療已經成為科學家治療多種難治性疾病的一種新手段，基因導入技術是基因治療的核心也是最基本的技術。目前研究較多的基因導入技術共分為兩大類：一，病毒載體基因導入法；二，非病毒載體基因導入法。前者轉染效率高,但存在安全性和免疫原性等問題。因此,近年來人們對非病毒類載體系統給予了更多的關注。關鍵詞： 非病毒載體 基因轉移技術 現狀和展望
非病毒載體基因轉移方法又分為物理方法和化學方法。物理方法如：注射法、基因槍法、電穿孔法、超聲波法等都是借助物理力量穿透細胞膜達到基因轉移的目的；化學方法則是借助天然的或者人工合成的化合物輔助完成基因轉移。盡管近年來在非病毒基因轉移領域中取得了顯著成效，但總體而言，非病毒載體相對于病毒載體來說轉移基因的效率要低，在體內的基因轉移尤其如此。現在把目前較常用的非病毒載體基因轉移方法的優勢和局限綜述如下。
1 物理方法
就是基于物理力量造成細胞膜的瞬間缺損，從而使質粒DNA進入細胞內的方法。如基因槍法、電穿孔法、超聲波法等，還有近年來發現的激光相關輔助方法。
1.1 注射法
直接將質粒DNA注射入組織細胞中達到基因轉移的目的。有學者成功地將裸露的質粒DNA注射入肌肉、肝臟[1]、皮膚[2]等組織，但基因表達水平較低。注射法中，細胞表面的某些受體起了一定的作用，它們能夠特異或者非特異性地結合DNA并且介導DNA的內吞，但這些受體的詳細作用機制不甚清楚。由于注射法有其獨特優點如：方法簡單，不需特殊試劑且毒性低而受到歡迎。此外，借助顯微操作系統進行的顯微注射法是目前國際上公認的制備轉基因和基因剔除動物模型的首選。
1.2 基因槍法
基因槍法是一種全新的基因導入技術，它以壓縮氣體（氦或氮）轉換成的氣體沖擊波為動力，把附著于高速微彈上的DNA直接射入細胞、組織和細胞器，基因槍導入的基因被證明可在廣泛類型的細胞中得到瞬時的、高效率的表達。基因槍法是皮膚、黏膜以及手術局部暴露組織較理想的基因轉移方法，因而基因槍被認為是將來DNA疫苗的良好免疫工具。但是基因槍法用于基因治療還需要進一步改進，如通過對微彈顆粒表面結構的改良使其可以結合更多的DNA或者使結合更緊密；通過對氣體沖擊波壓力的調節來調控微彈的運動軌跡等。
1.3 電穿孔法
通過短暫的高強度的電場作用，瞬時提高細胞膜的通透性，從而將周圍介質中的外源核酸分子導入細胞內。電穿孔法是一種既可以用于體外也可以用于體內的基因轉移方法。理論上任何可以插入兩個電極的組織器官都可以用電穿孔法導入外源基因，然而目前體內用電穿孔法導入基因主要用于皮膚和肌肉組織。100KD的DNA被報道可以利用電穿孔的方法成功導入肌肉組織中[3]。電穿孔導入的外源基因也有被報道長期穩定表達超過1年時間[4]。本課題組前期工作中利用電穿孔法將質粒pGFP?N2導入白血病細胞株K562中后，經過篩選培養，最終表達綠色熒光的細胞高達90％以上,穩定表達時間在半年以上[5]。該方法轉移基因時，DNA的濃度以及DNA在組織中的分布對電穿孔的效率至關重要。用電穿孔法進行體內基因導入時存在如下局限：①兩個電極的距離不能超過1cm，這樣就很難實現大面積的細胞同時基因轉移；②如果是內臟的基因導入，必須借助外科手術放置電極，損傷較大；③該法所用的電壓較高，容易導致局部組織細胞被電灼傷。此外，較高電壓作用于細胞后可能會影響細胞自身基因組DNA的穩定性。以上局限性有望通過對電極的優化及電場強度的調節而減少到最低。值得一提的是現在出現了類似于傳統電穿孔法的細胞核轉染法，借助細胞核轉染儀，采用獨特的電場參數與細胞類型特異性的轉染溶液相結合的方法，將細胞轉染效率大大的提高，而細胞的死亡率則大大的降低。轉染條件對于不同的細胞不需要摸索和優化，而且絕大多數細胞被轉染后4h就可以見到轉染基因的表達。
1.4 超聲波法
超聲波在醫學領域分為診斷性超聲和治療性超聲。治療性超聲常用于組織深部加熱、緩解局部疼痛和促進炎癥吸收等。超聲在一定的波長和強度下能增加血管和細胞膜的通透性，尤其有利于全身用藥和轉基因時藥物和DNA在局部組織細胞的定位。超聲波法比單純DNA注射法的基因轉移效率要高10～20倍。該法用于基因轉移的效率受諸多因素影響：如超聲波的頻率、強度和作用時間以及所用質粒DNA的量等。此外，由于造影劑在超聲波作用下變為迅速擴張和縮小的含氣泡沫，從而在局部產生波動，使臨近細胞膜通透性瞬間增加，所以造影劑的使用可以增加超聲波的基因轉移效率。與電穿孔不同，超聲波作用后細胞膜出現微孔，基因通過自由擴散的方式通過微孔進入細胞，因而質粒DNA的大小及濃度對基因轉移效率影響較大。超聲波用于體內組織器官基因導入的優勢在于其為一種無創的基因轉移方法。然而到目前為止，超聲波用于基因轉移的主要局限在于其效率較低。
2 化學方法
目前非病毒載體基因轉移方法中研究最熱門的還是陽離子脂質體和陽離子聚合物介導的基因轉移，攜帶目的基因的陽離子脂質體或聚合物通過細胞吞噬或吞飲作用進入靶細胞中，一部分目的基因將在胞漿中被釋放出來并轉移入細胞核發揮作用。
2.1 陽離子脂質體介導的基因轉移
自從Felgner等科學家[6]于1987年首次發現脂質體具有轉移基因的作用后，大量的陽離子脂質體被改良后用于基因的轉移。這些脂質體主要區別在于它們所帶電荷及細微結構的不同。盡管有部分脂質單獨就可以形成囊泡發揮較好的基因轉移作用，但很多陽離子脂質需要磷脂或者膽固醇輔助作用下才能形成脂質體囊泡。當把目的DNA與這種脂質體混合后，DNA就會濃縮并與之形成較穩定的脂質體DNA復合物(lipoplex)。由于脂質體具有類似生物膜的性質，因此當脂質體DNA復合物與細胞膜接觸后，通過胞吞作用而進入胞內。如今不斷改良的陽離子脂質體試劑在穩定轉染、瞬時轉染以及難以轉染的細胞系應用中都表現出超乎尋常的效果。此外，脂質體沒有免疫原性,細胞毒性小,而且也易于制備,因此陽離子脂質體已成為現今用于基因轉移的最常用方法之一。
為了達到特異性基因轉移的目的，科學家們相繼開發了免疫脂質體和配體脂質體[7]。免疫脂質體或配體脂質體的靶向技術是通過將脂質體與單克隆抗體或配體共價結合成免疫脂質體或配體脂質
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